波尔山羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定

波尔山羊养殖场从上海某种羊场引入一批波尔山羊，引入几个月就发现一只大公羊体表淋巴结主要是肩前淋巴结和股前淋巴结发生脓肿，此后，同舍内的母羊也相继受到感染。由于该羊群是放养，羊舍墙壁为土墙，发生脓疱的羊在墙上磨擦，脓疱破溃，污染羊舍和草地，所以很快波及全群。大羊发生率高，小羊发生率低。

       发病羊体表淋巴结特别是肩前淋巴结和股前淋巴结发生脓肿，随着时间的延长，脓肿逐渐增大，最后形成如鸡蛋大小的脓疱，干酪样淋巴腺炎。切开脓疱，脓汁质地均匀如牙膏状，呈白色至灰白色，没有臭味。病羊皮肤痒，经常相互磨擦或在墙上磨擦，最后脓疱破溃。严重的病羊发生全身性感染，表现为咳嗽、食欲下降、体重下降。母羊被感染后，除了发生干酪样淋巴腺炎外，还发生流产。此次分离到的伪结核棒状杆菌在我省尚属首次，报告如下。

1  材料与方法

        1.1  病料采集  用毛剪剪去病灶外的毛，先用碘酊消毒，后再用酒精消毒，然后用灭菌玻璃注射器从病羊的体表脓疱抽取脓汁，装于灭菌试管内，供分离用。

   1.2  培养基  主要有普通琼脂平板，牛血清马丁肉汤，全血琼脂平板，亚碲酸钾血液琼脂平板选择培养基，吕氏血清斜面，均由本实验室配制。

       1.3  直接涂片染色镜检  取脓汁用生理盐水适当稀释后涂片，用革兰氏染色镜检。

   1.4 细菌的分离培养  取脓汁接种于血清肉汤中，5%~10% CO2条件下培养24~48 h后，染色镜检，如有疑似该菌再进一步进行鉴别培养。

   1.5 鉴别培养  取肉汤培养物分别接种于普通琼脂平板、全血琼脂平板、亚碲酸钾血液琼脂平板等选择培养基，观察菌落特点。

      1.6  异染颗粒检查  把纯化菌接种于吕氏血清斜面培养24~48 h，取此培养基上的菌体，用Albert法染色。

   1.7  生化试验  取纯培养物，接种于相关的生化试验培养基中培养48 h观察结果。

      1.8  动物实验  取血清肉汤48 h纯培养物，分别接种于家兔和小鼠。家兔一组皮下接种2 ml，另

一组腹腔接种2 ml，小鼠腹腔接种0.5ml。每日观察。

2  结果

       2.1  直接涂片染色镜检  脓汁直接涂沫于载玻片上干燥、固定，革兰氏染色后于显微镜油镜下观察，可见到大量杆状或球杆状革兰氏阳性菌，排列呈典型的栅状。球杆状菌的排列与葡萄球菌的排列颇为相似。无芽孢、鞭毛及荚膜。

       2.2  细菌的分离培养  血清肉汤中，初次分离在5%~10% CO2的条件下，37℃培养24 h后肉汤轻度混浊，48h后，菌体沉淀于管底，上部变为澄清。

    2.3  血液琼脂上，37℃ 18~24h的培养，长出直径小于1mm的菌落，半透明；随培养时间延长变为不透明，呈乳白色。菌落周围有狭窄的β型溶血带。继续培养，菌落增大，常带黄色，有同心圈、趋于干燥而松脆。菌落在琼脂培养基表面上容易被推动，且不破坏或留下痕迹。在普通营养琼脂上、基本不长。亚碲酸钾血液琼脂平板选择培养基上，37℃培养24~48 h形成带黑色的菌落。

       2.4 动物实验  家兔皮下接种2ml菌液，4~5天内死亡，剖检：肝脏见有典型的白色或黄色坏死灶，脾脏肿大，接种部位出现化脓灶，切开见有白色牙膏样化脓汁；腹腔接种家兔，2天内死亡，剖检内脏器官均有出血，特别是肠系膜；小鼠腹腔接种0.5 ml，1天内死亡。

 
3  小结与讨论

   3.1  根据流行病学、临床症状、病理变化、实验室诊断（涂片染色镜检，分离培养，生化鉴定，动物实验）确定我省某波尔山羊场发生的干酪样淋巴结炎为伪结核棒状杆菌感染所致。

   3.2  羊伪结核棒状杆菌主要引起绵羊、山羊发生以干酪样淋巴结炎为特征的慢性传染病。澳大利亚、美国及日本等国家或地区均有本病发生。我国的一些地区或牧场也曾发生过本病，但在北方较为常见，如内蒙古，而在南方本病较少，福建省尚未报道。

   3.3  伪结核棒状杆菌被吞噬细胞带到临近的淋巴结或脏器后开始增殖，并导致细胞不断破碎和局部组织坏死。由于病灶形成缓慢，水分不断吸收，加之菌体

发育过程中菌落干燥的特性，故脓汁呈干酪样，典型者切面呈同心圆状。

   3.4  由伪结核棒状杆菌引起的病灶及其形成过程与干酪样结核结节基本相似，表面包有一层厚而致密的纤维性肉芽肿性包囊，诸多药物都难以通过这层包囊而无法渗入其内，这是该病难以治疗的最主要原因之一；此外，伪结核棒状杆菌可寄生于细胞内，也使得一些药物对其难以发挥作用。同时，赵宏坤等人研究发现有些药物即使能够由脓肿包囊的较薄或开放部位进入脓肿内，但由于受其穿透性和残效期所限，加上脓汁非常干稠，使得药物难以均匀地扩散于整个脓肿，因而不能彻底杀死脓肿内的病原菌。他们先后进行过伪结核棒状杆菌对27种抗生素和40种中草药的敏感性试验，及其部分药物对脓肿病灶的穿透性试验。最终研制成功了治疗该病的一些特效药物（如利福平），同时通过采用相关穴位非对称性注射疗法，使药效得以充分发挥，连用9日即可彻底杀死脓肿内的病原菌。鉴于该病治疗的困难性，我们建议采用两种方法净化羊群，第一，在治疗同时，加强对环境和羊体表的消毒。淋巴结排脓时，脓汁应集中销毁，以免再次污染。第二，采用超早期断奶（1~3日龄）的方法，隔离新生小羊，重新培养健康羊群。

      3.5 对本病还没有供临床使用的疫苗，据赵宏坤等人研究表明，将伪结核棒状杆菌用含15%吐温80的肉汤37℃培养1周，加入04%甲醛，置4℃灭活1周，弃掉部分上清后加入马红细胞苗协同溶血因子等佐剂制备菌苗，皮内接种供试羊耳背部，分别于免疫接种后4周和6个月，用伪结核棒状杆菌进行攻毒，结果，背部皮内接种4周后即可产生坚强的免疫力，能抵抗107~1010个伪结核棒状杆菌的攻击，免疫期达半年以上。因此，对于有条件的单位是否可考虑应用自家苗进行免疫。